新时代下的mRNA疫苗发展概述

mRNA疫苗的发展历史

mRNA是一种中间信使，通过各种途径传递到宿主细胞中后被翻译成抗原。二十多年来，RNA分子多次被应用于疾病治疗和研究，包括体外转录(IVT)mRNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA适体、核糖开关、反义RNA以及mRNA疫苗等。mRNA分子可以直接传递到细胞中，用于操纵基因表达或产生目标蛋白质的想法在20世纪80年代末首次得到验证。Malone等人首先证明了使用阳离子脂质N-[1-（2,3-二乙氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵在NIH3T3成纤维细胞中能够高效转染mRNA。在接下来的二十多年里，将mRNA分子转染到宿主细胞中以表达目的基因的想法经历了几次技术层面的改进（图1、图2）。

图1 基于mRNA的药物技术发展的一些关键发现和进展的时间表

绿色框代表mRNA机制的发现和进展；蓝色框代表基于mRNA的药物应用的发现和进展

图2 mRNA疫苗接种目标和里程碑

mRNA疫苗的种类

疫苗的开发通常可分为两类：基于基因的和基于蛋白质的。基于蛋白质是传统的方法，依靠减毒或重组蛋白直接作为免疫原传递，以激活适应性和体液免疫应答。基于基因的疫苗通过DNA或RNA载体传递到宿主细胞并表达，以产生相应的抗原，诱导宿主的免疫反应。

基于核酸（包括病毒载体、质粒DNA（pDNA）和mRNA）的疫苗，适合于快速反应及应用，因为它们能够诱导广泛的保护性免疫反应，并且有可能通过快速灵活的制造工艺产生。pDNA和病毒载体已被评价为疫苗平台，并证明了其安全性和免疫原性。然而，pDNA进入靶细胞的细胞核相当低效，而且病毒载体可以诱导针对病毒结构蛋白的干扰性载体特异性免疫应答，特别是在增强免疫应答时。在过去的十年中，人们开始对基于mRNA的疫苗产生越来越大的兴趣，并开展了越来越多的研究活动。

图3 疫苗平台的比较

从病毒本身衍生的疫苗（左）和核酸疫苗，例如自扩增RNA疫苗（右）。核酸疫苗源自对病毒基因组的认识，其中糖蛋白被编码成核酸，并通过合成载体（如脂质纳米颗粒）或惰性病毒（如腺病毒）输送系统进行传递。编码抗原序列随后由宿主细胞表达。

mRNA疫苗的第一个优点是制造简单、速度快。mRNA疫苗的核心原理是提供编码靶抗原或免疫原的转录本。一旦编码免疫原的序列可用，RNA合成可立即在同一平台上进行，该过程易于扩展且不依赖于细胞，在mRNA配制和制造过程中平台变化最小。其次，mRNA 疫苗在转染后通过从 mRNA 快速翻译来表达靶蛋白（抗原）。mRNA 疫苗比基于 DNA 的疫苗具有更高的生物安全性，因为抗原的翻译发生在细胞质而不是细胞核中，因此与基于 DNA 的疫苗相比，mRNA 整合到基因组中的可能性要小得多。此外，mRNA是一种比DNA更安全的载体，因为mRNA携带要翻译的短序列，是一种瞬时分子，并且不与宿主基因组相互作用。第三，基于蛋白质的疫苗通常由细菌产生，而mRNA疫苗则由宿主翻译机制翻译，因此可能形成一种抗原，模仿病毒基因组表达的蛋白质结构，包括翻译后修饰。

然而，mRNA疫苗的储存和运输需要超低温，而基于蛋白质的疫苗可以在不太严格的条件下储存和运输。据报道，COVID-19疫苗在室温下能够保持24小时稳定。因此，在温暖的国家和地区储存和转移数以百万计的mRNA疫苗是一个巨大的技术障碍和经济负担。然而，随着脂质纳米粒技术的发展，mRNA疫苗的稳定性可以在不太严格的条件下维持。

目前，已开发出两种形式的mRNA疫苗：编码侧翼为5'和3'UTR的目标抗原的传统mRNA（非复制型），以及源自正链RNA病毒基因组的自扩增mRNA（saRNA）。自扩增mRNA不仅编码抗原，还编码导致高水平抗原表达的细胞内RNA扩增所需的病毒复制机制（图4）。表1总结了每种mRNA技术的独特属性，以及需要克服的障碍。

图4 mRNA疫苗的类别及抗原表达机制示意图

传统mRNA携带感兴趣抗原（GOI）的编码序列，两侧为5′和3′UTR、末端5′帽结构和3′聚（A）尾。一旦进入细胞并从内体释放到细胞质中，mRNA立即被翻译。自扩增mRNA通常来源于正链单链RNA病毒（如α病毒）的基因组，它编码相关抗原和细胞内RNA扩增和高水平抗原表达所需的病毒非结构蛋白（nsPs）。自扩增的mRNA可以指导其自扩增产生RNA中间体和许多编码亚基因组mRNA的抗原拷贝，从而产生高水平的编码抗原。传统的mRNA疫苗和自扩增的mRNA疫苗都需要一个用于细胞摄取的递送系统，通常通过内吞作用，然后将mRNA从内体卸载到细胞质中，在细胞质中进行翻译和蛋白质处理以进行MHC呈递。一旦进入细胞，mRNA几乎立即被内体和细胞质中的模式识别受体（PRR）感知，PRR如Toll样受体TLR3、TLR7和TLR8定位于内体，胞质传感器如RIG-I、MDA5、PKR和OAS也识别细胞质中的双链和单链RNA。

表1 不同mRNA的优缺点

与非扩增RNA相比，自扩增RNA更具mRNA疫苗的优势，如快速开发、模块化设计和无细胞合成。由于其自身复制特性，需要较低剂量的RNA，从而减少了原料药和产品的生产负担，在应对大流行方面具有潜在优势，能够使大量的人口在短时间内接种疫苗。

saRNA疫苗起源于甲型病毒基因组，这种疫苗包含一个负责病毒RNA复制的基因和另一个编码治疗性抗原的转基因。根据获得抗原表达的不同方法，自扩增RNA包括基于DNA质粒的saRNA、病毒样颗粒递送的saRNA和体外转录的saRNA（图5）。

图5 基于α病毒复制子RNA进行抗原编码mRNA表达

A）基于DNA质粒的saRNA使用质粒DNA作为载体，将复制酶基因和转基因转移到细胞核中，并在细胞核中翻译mRNA。B) 病毒样颗粒包裹saRNA，并通过受体介导的内吞作用将复制子RNA传递到细胞质，形成内体。C) 体外转录的 saRNA 以盐水或合成制剂形式递送。

mRNA疫苗的抗原设计

迄今为止，mRNA的体外转录技术已经成熟，最常用的方法是使用T3、T7或sp6RNA聚合酶和线性DNA（线性化质粒DNA或PCR制备的合成DNA）进行mRNA合成。在真核细胞中，成熟mRNA的一些基本结构元件是保持mRNA功能所必需的，包括5′帽（5′ cap）、5′端非翻译区（5′ UTR）、开放阅读框（ORF）区、3′端非翻译区（3′ UTR）和poly（A）尾结构，保持 mRNA 结构完整有利于 mRNA 稳定性和表达能力。基于其完整结构修饰 mRNA 序列可以进一步优化 mRNA 疫苗的效率（图1）。

图1 mRNA疫苗设计示意图

mRNA分子在体外合成，具有cap结构（m7GpppNm），尿苷被假尿苷取代，人类使用优选密码子，优化UTR和polyA尾序列。这些修饰提高了RNA稳定性和翻译效率并降低了免疫原性。

mRNA疫苗的递送

有效的体内传递对于mRNA疫苗达到预防作用至关重要。为了转化为免疫原蛋白，外源mRNA必须穿过宿主细胞膜的屏障进入细胞质。由于mRNA疫苗的不稳定性，mRNA疫苗的引入需要一些载体的协助。因此，科学家开发了基于脂质的递送、基于聚合物的递送、基于肽的递送、病毒样复制子颗粒递送和阳离子纳米乳液递送（图2、图3、表1）。此外，裸mRNA疫苗也可以直接注射到细胞中。迄今为止，新开发的基于DC的mRNA疫苗用于诱导适应性免疫。

图2 mRNA疫苗的主要递送方法

图3 mRNA疫苗的主要递送方式

图中展示了mRNA疫苗的常用递送方法和载体分子以及颗粒复合物的典型直径：裸mRNA（a部分）；体内电穿孔裸mRNA（b部分）；鱼精蛋白（阳离子肽）-复合的mRNA（c部分）；与带正电荷的水包油阳离子纳米乳液相关的mRNA（d部分）；mRNA与化学修饰的树枝状大分子相关并与聚乙二醇(PEG)-脂质复合（e部分）；PEG-脂质纳米颗粒中的鱼精蛋白复合mRNA（f部分）；与阳离子聚合物（例如聚乙烯亚胺(PEI)）相关的mRNA，（g部分）；与阳离子聚合物如PEI和脂质成分相关的mRNA（h部分）；与多糖（例如壳聚糖）颗粒或凝胶（i部分）相关的mRNA；阳离子脂质纳米颗粒中的mRNA（例如，1,2-二油酰氧基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)脂质）（j部分）；与阳离子脂质和胆固醇复合的mRNA（k部分）；和与阳离子脂质、胆固醇和PEG-脂质复合的mRNA（l部分）。

表1 mRNA的递送系统

LNP是应用最广泛的平台，已被证明在mRNA传递方面具有最佳的临床效果。LNP主要由可电离脂质、胆固醇、磷脂和聚乙二醇（PEG）-脂质组成（图4）。

图4 mRNA脂质纳米粒复合物的示意图

LNP最初被设计用于传递siRNA，现被应用于mRNA的传递，并作为最具临床可翻译性的非病毒传递载体出现。LNP主要由可电离的氨基类脂分子、辅助磷脂、胆固醇和脂质锚定聚乙二醇（PEG）组成。可电离脂质是一种两亲性结构，具有亲水性头基（包含一个或多个可电离胺）、能够促进自组装的烃链和连接头基与烃链的连接体。可电离脂质设计用于在低pH值下通过游离胺质子化获得正电荷，主要用于两个目的：（1）在制备LNP期间，带正电荷的脂质可通过静电相互作用促进带负电荷的mRNA的封装；（2）在细胞内输送LNP后的酸性内体微环境中，带正电的脂质可与离子内体膜相互作用，促进膜融合和失稳，导致LNP和内体释放mRNA。

在生理pH值下，可电离脂质保持中性，提高稳定性并降低全身毒性。具有代表性的可电离脂质包括：Dlin-DMA、Dlin-KC2-DMA和Dlin-MC3-DMA，它们是在合理设计的基础上合成的；C12–200和cKK-E12则通过组合文库的高通量筛选；下一代COVID-19脂质，包括DLN-MC3-DMA衍生物L319、C12—200和CKK-E12衍生物、COVID-19疫苗脂质ALC-0315和SM-102、TT3和生物可降解衍生物FTT5、维生素衍生脂质SSPALME和VCLNP、A9、L5、A18脂质、ATX脂质和LP01，它们大部分是可生物降解的（图5）。除可电离脂质外，加入磷脂（DOPE和DSPC）和胆固醇可以改善脂质双层稳定性、辅助膜融合和内体逃逸。脂质锚定PEG可减少巨噬细胞介导的清除。更重要的是，脂质锚定PEG有助于防止颗粒聚集并提高储存稳定性。

图5 临床前研究和临床试验中使用的代表性 LNP 结构和可电离脂质

mRNA疫苗的生产

一旦确定病原体或宣布爆发，病原体和抗原的基因组将通过组合测序、生物信息学和计算方法确定（如果尚未获得）。候选疫苗抗原序列以电子方式存储，可在全球范围内用于mRNA疫苗的计算机设计，然后通过分子克隆或合成构建质粒DNA模板。中试疫苗批次是在无细胞系统中通过mRNA的体外转录和加帽、纯化和使用递送系统的配制而产生的。进行过程中分析和效力测试，以评估试验性mRNA疫苗批次的质量。如果需要，可以在免疫原性和/或疾病动物模型中进一步测试试验性mRNA疫苗批次。最终的mRNA疫苗是通过一个通用的过程进行放大和制造的，只需很少的修改，可快速测试并派送使用（图6）。

图6 mRNA疫苗生产示意图

与传统疫苗相比，mRNA最重要的优势之一是其制造相对简单。为了生产具有特定质量属性的mRNA产品，必须执行一系列制造步骤。目前，仍然缺乏一个完善的制造平台，并允许进行多种步骤的组合。这些可分为上游加工（包括酶促生成mRNA）和下游加工（包括纯化mRNA产物所需的单元操作）（图7）。

图7 mRNA 疫苗制造过程的生产和纯化步骤的示意图

mRNA生产可在一步酶促反应中进行，其中使用加帽类似物，或在两步反应中进行，使用痘苗加帽酶进行加帽。实验室规模的mRNA纯化过程包括 DNase I 消化，然后是 LiCl 沉淀。采用成熟的色谱策略，结合切向流过滤，可获得更大规模的纯化；也可以使用新型色谱法来补充标准纯化。

必须改进目前的IVT mRNA生产方法，使mRNA技术商业化，并支持市场需求。由于工艺产量和生产规模对制造成本和每剂成本有影响，推测连续加工将具有降低成本的特殊优势。连续加工已经在化学和制药行业中使用，以运行灵活且经济高效的流程，并最终提供按需生产。此外，通过连续制造实现的过程集成还可以缩短操作时间，促进自动化和过程分析技术（PAT），从而提高生产率和产品质量。mRNA制造的相对简单性使得该过程非常适合于连续加工，尤其是在微流体规模下（图8）。

图8 生产mRNA疫苗的连续制造工艺的概念设计

该过程包括连续形式的两步酶促反应，然后使用切向流过滤策略和两个多模式色谱步骤进行酶循环，一个在结合-洗脱模式下进行中间纯化，另一个在流动模式下进行精制，并使用第三个切向流过滤模块实现配方。

接种疫苗的位置会影响诱导的免疫反应

除了疫苗成分本身，递送的方式和位置也会影响其效力（图1）。疫苗通常被注射到肌肉或皮下脂肪组织中，其它非传统途径，如经鼻、脾内、皮内、鼻内、静脉和肿瘤内，也被广泛应用。次级淋巴器官的特点是大量免疫细胞的密集存在，如APC和T细胞，为有效诱导适应性免疫反应创造了理想的场所。树突状细胞是一种高度特化、异质性的APC亚群，它将病原体的先天与适应性免疫的激活联系起来。

图1 mRNA 注射的不同位置诱导的免疫反应

图中列出了不同方式的优缺点。总的来说，用mRNA直接转染APC并不是有效诱导免疫应答的必要先决条件，全身注射原则上是可行的。将mRNA直接注射到次级淋巴组织有助于靶向抗原递送到APC，无需DC迁移。肌肉内和皮内注射疫苗可引发更持久的蛋白质表达。另外，在一项研究中，与静脉注射相比，皮内注射的mRNA编码的荧光素酶的半衰期延长了三倍。

一旦mRNA分子从LNP释放到细胞质中，它就会被toll样受体（TLR）如TLR3或7/8以及维甲酸诱导基因（RIG）-I感觉到，维甲酸诱导基因（RIG）-I促进I型干扰素（IFN）分泌到细胞外基质，从而创造一种有利于Th1应答而非Th2应答的环境。mRNA由核糖体直接翻译成多肽，由蛋白酶体系统处理，导致肽呈递到细胞表面的MHC-I上（类似于病毒感染期间），并经翻译后修饰折叠成蛋白质，根据mRNA设计，可以是膜锚定的或分泌的。在细胞外蛋白质或含有蛋白质的细胞碎片摄取蛋白质后，APC上可能出现MHC-II上的肽呈递（图2）。

图2 细胞摄取LNP包被的mRNA疫苗后的反应

图3 mRNA疫苗对免疫功能的影响

a)外源mRNA对先天免疫的影响。内体中的TLR以及细胞质中的RIG-I和MDA5等受体可以检测外源mRNA。dsRNA可以诱导强烈的IFN1反应。源自翻译蛋白的肽将在蛋白酶体中加工并呈现在MHC-I和MHC-II分子上。b)外源mRNA对适应性免疫的影响。APC可以将MHC-II上的外源抗原呈递给CD4+T细胞，并在MHC-I上交叉呈递给CD8+T细胞。CD4+T细胞为B细胞和CD8+T细胞提供帮助。最后，抗原特异性B和T细胞的克隆扩增导致靶细胞消除。c)肿瘤免疫逃避的风险。肿瘤能够通过招募骨髓源性抑制细胞(MDSC)、调节性T细胞、M2巨噬细胞和产生免疫抑制细胞因子来创造免疫抑制微环境。例如，T细胞上耗竭标志物的上调或肿瘤细胞上的抗原丢失可以进一步推动免疫逃避。CPI（免疫检查点抑制剂）可能有助于重新获得免疫监视。

图4、图5、图6展示了mRNA疫苗引发天然免疫应答反应的机制。

图4 外源mRNA引发的先天免疫应答机制

IVT合成的mRNA疫苗由PRR（包括内体TLR3、-7和-8，以及细胞质固有免疫受体RIG-I和MDA5）识别。由不准确的T7聚合酶活性产生的dsRNA被TLR8和RIG-I识别，以诱导促炎细胞因子的表达，并促进由2′-5′-寡腺苷酸合酶/RNase L和依赖PKR的eIF2α磷酸化介导的RNA降解和翻译抑制。

图5 mRNA体外转录和先天免疫激活

（A）mRNA体外转录。以具有抗原编码序列的DNA为模板，mRNA体外转录产物含有单链RNA（ssRNA）、双链RNA（dsRNA）等。ssRNA结构通常包括5′cap、5′UTR、开放阅读框（ORF）区、3′UTR和poly（A）尾结构

（B） RNA翻译和抗原呈递。mRNA通过内吞作用进入细胞质。一些mRNA与宿主细胞的核糖体结合并成功翻译。抗原蛋白可被细胞质中的蛋白酶体降解为抗原肽，并通过主要组织相容性复合体（MHC）I途径呈递给细胞毒性T淋巴细胞（CTL）；或者，它们可以从宿主细胞中释放出来，并由DCs接收。然后，它们被降解并通过MHC-II途径呈递给辅助性T细胞和B细胞。B细胞也能识别释放的抗原蛋白

（C）自身辅助效应。各种模式识别受体（PRR）可以识别mRNA的体外转录产物。ssRNA可由内体固有免疫受体（例如Toll样受体7（TLR7）、TLR8）识别。dsRNA可由内体固有免疫受体（如TLR3）和细胞质固有免疫受体（PKR、RIG-I、MDA5和OAS识别。在此基础上，mRNA产物可以刺激促炎细胞因子和I型干扰素（IFN）的分泌，从而导致抗原呈递细胞（APCs）的激活和炎症反应。然而，它们也可激活导致mRNA翻译停滞和mRNA降解的抗病毒酶。

图6 mRNA疫苗的天然免疫传感

树突状细胞（DC）对两种mRNA疫苗的先天免疫感应，RNA感受器显示为黄色，抗原显示为红色，DC成熟因子显示为绿色，肽-主要组织相容性复合体（MHC）复合物显示为浅蓝色和红色；右上角显示了脂质纳米颗粒载体的示例。图中展示了有助于识别双链和未修饰单链RNA的主要已知RNA感受器的非详尽列表，选择未修饰、未纯化（a部分）和核苷修饰、快速蛋白液相色谱（FPLC）纯化（b部分）的mRNA来说明两种形式的mRNA疫苗，二者分别具有和不具有已知形式的mRNA传感。虚线箭头表示抗原表达减少。Ag，抗原；PKR，干扰素诱导，双链RNA活化蛋白激酶；MDA5，干扰素诱导的含螺旋酶C结构域的蛋白1（也称为IFIH1）；IFN，干扰素；m1ψ，1-甲基假尿苷；OAS，2′–5′-寡腺苷酸合成酶；TLR，Toll样受体。

图7展示的是mRNA疫苗引发机体适应性免疫应答的机制。

图7 mRNA疫苗接种引发的适应性免疫反应

注射部位的局部炎症促进免疫细胞（包括中性粒细胞、单核细胞、髓样树突状细胞（MDC）和浆细胞样树突状细胞（PDC））的浸润。中性粒细胞可以有效地吸收LNP，但单核细胞和MDC更有效地翻译mRNA。I型干扰素（IFN）被刺激分泌。mRNA/LNP和蛋白质抗原将扩散，细胞将迁移到疫苗引流淋巴结。抗原呈递给T细胞和抗原与B细胞的相互作用发生在这些部位。这会引起生发中心的形成，从而产生驻留在骨髓中的记忆 B 细胞和产生抗体的浆细胞。

针对COVID-19的mRNA疫苗

与包括 SARS 和 MERS 在内的其他人类冠状病毒一样，SARS-CoV-2 是一种有包膜的、正链的单链 RNA 病毒，其基因组 RNA 编码非结构多聚蛋白和结构蛋白，包括刺突 (S)、包膜 (E)、膜 (M) 和核衣壳 (N) 蛋白。作为表面蛋白，S、E和M蛋白插入病毒包膜，S糖蛋白赋予病毒颗粒一个“冠”和名称。N蛋白包围着正链基因组RNA。SARS-CoV-2利用S蛋白进入宿主细胞，S 糖蛋白全长 1,273 个氨基酸，由 N 端信号肽、胞外域、跨膜域和胞内域组成，在功能上分为 S1 和 S2 亚基（图1A）。受体结合域 (RBD) 位于 S1 亚基的 C 端，负责与人血管紧张素转换酶 2 (hACE2) 结合，S2 介导膜融合。融合前的 S 结构揭示了 S1 亚基的四个结构域，N 端结构域 (NTD)、RBD、C 端结构域 (CTD)1 和 CTD2，环绕 S 三聚体的三重轴并覆盖下面的 S2 片段 ; S2 亚基似乎是一个对称的三聚体，其中第一个七肽重复序列 (HR1) 向病毒膜弯曲（图1B）。融合后构象的 SARS-CoV-2 S 三聚体的结构表明，经过大量的结构重排后，HR1 和中央螺旋 (CH) 形成了一个异常长的、中央的、三链卷曲螺旋（图1C）。此外，据报道，SARS-CoV-2 S 蛋白向融合后状态的自发转变与靶细胞无关，当全长 S 编码质粒转染细胞时，融合前和融合后 S 蛋白均会生成。S蛋白在融合前构象状态下的高度不稳定性无疑是S基疫苗开发中的一大障碍。幸运的是，在CH开始时引入两个连续的脯氨酸残基（2P）是将β-冠状病毒S蛋白保留在融合前构象中的通用策略。脯氨酸有限的骨架扭转角可能不利于 CH 和 HR1 之间的接头的重折叠，阻止 S 蛋白转变为融合后构象。此外，SARS-CoV-2 S-2P 突变体的冷冻电镜结构表明 2P 取代不会改变 S 蛋白的构象（图1D）。同时，还报道了包括RBD-hACE2和RBD-单克隆抗体在内的多种结构。RBD 包含两个结构子域，其中五个反向平行的 b 链包含一个保守的核心子域，另一个外部子域由识别 hACE2 的二硫键稳定的柔性环控制（图1E）。此外，RBD 和 S-2P 蛋白都可以诱导有效的 SARS-CoV-2 中和抗体和 T 细胞反应。因此，它们被广泛用作 COVID-19 mRNA 疫苗开发中的免疫原。

图1 COVID-19 mRNA 疫苗的抗原

A：按域着色的全长SARS-CoV-2S一级结构的示意图。SS，信号肽；NTD，N-末端结构域；RBD，受体结合域；CTD，C端域；FP，融合肽；HR1，七肽重复1；CH，中心螺旋；CD，连接器域；HR2，七肽重复2；TM，跨膜结构域；CT，细胞质尾。B：SARS-CoV-2野生型S蛋白在融合前状态的结构。C：SARS-CoV-2野生型S蛋白在融合后状态的结构。D：SARS-CoV-2S-2P的结构。E：SARS-CoV-2RBD的结构。

mRNA疫苗包含S蛋白编码区，两侧为优化的5’-和3’-UTR和polyA尾，通过IVT合成，然后用5’-帽模拟物进行5’-加帽，并用LNP封装用于IM注射（肌肉注射）（图2 步骤1）。疫苗通过内吞作用进入肌肉细胞或抗原呈递细胞，如树突状细胞或巨噬细胞（步骤2）。mRNA分子从LNP中卸下并在核糖体中翻译为S蛋白（步骤3）。新合成的S蛋白分泌到细胞外空间，通过内吞作用内化到抗原呈递细胞中，并作为MHC II类抗原呈递复合物的一部分（步骤5b，6b，和7）将抗原呈递给免疫细胞，包括T细胞和B细胞。蛋白质体部分降解的S肽被整合到MHC I类复合物中，然后将其转运至质膜并作为抗原呈递给免疫细胞（步骤4a、4b、5a和7）。

图2 COVID-19 mRNA疫苗的传递和工作机制

凭借其通用性和快速发展的优势，两种COVID-19mRNA疫苗（mRNA-1273和BNT162b2）已获准上市，一种候选药物处于III期临床试验，另外三种候选药物目前处于I或II期临床评估。根据临床前实验或临床试验的已发表数据，表1列出了临床试验中的所有COVID-19mRNA疫苗或候选疫苗，并总结了它们的安全性、中和抗体反应和保护功效。

表1 COVID-19 mRNA疫苗的临床应用

BNT162b2是一种脂质纳米粒制剂，核苷修饰的mRNA疫苗，用于预防由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染引起的新型冠状病毒病2019（COVID-19）。BNT162b2编码的SARS-CoV-2 S蛋白表达可诱导受体对抗原的免疫应答。BNT162b2以两剂方案肌肉注射给药。保护率可达95%。

BNT162b2需要冷藏（对疫苗的分发构成后勤挑战），并且必须在使用前解冻和稀释。稀释后，每个小瓶包含六个 30 µg 剂量。BNT162b2 以两个 30 µg 剂量的疗程肌肉注射（理想情况下进入三角肌），推荐剂量间隔为 21 天。在第二剂给药后 7 天，可能无法实现对 COVID-19 的完全保护。与其他疫苗的情况一样，BNT162b2 可能无法保护每个接受者。

作用机理

BNT162b2由脂质纳米粒包裹的核苷修饰mRNA组成，该mRNA编码膜锚定的全长SARS-CoV-19 S蛋白，并且包含突变，该突变使S蛋白以抗原首选的融合前构象稳定。脂质纳米粒保护非复制RNA不被降解，并允许其在肌肉注射后进入宿主细胞。一旦进入宿主细胞，mRNA被翻译成SARS-CoV-2 S蛋白，该蛋白在宿主细胞表面表达，诱导中和抗体和针对其的细胞免疫反应（图3）。

图3 肌肉注射BNT162b2的作用机制

尽管mRNA疫苗在过去几年中呈现出明显的优势，但直到SARS-CoV-2大流行显著加速和加速了临床试验和审查，人类才批准使用第一种mRNA疫苗。这无疑是疫苗接种史上的一个里程碑，如果成功，基于mRNA的疫苗可能成为未来大流行的即时“标准”解决方案，但也可能取代一些常规的基于蛋白质的减毒活疫苗。mRNA平台也可能优于其他平台，能够最快速地修改和分布，以对抗大流行期间出现的新变异病毒株。

基于过去十年中mRNA疫苗平台的重大技术创新和进步，抗COVID-19的mRNA疫苗以前所未有的速度研制成功。在临床试验中，与蛋白亚单位疫苗和灭活病毒疫苗相比，COVID-19 mRNA疫苗显示出更高的系统性不良事件发生率，如发热和疲劳。因此，有必要长期监测COVID-19 mRNA疫苗的安全性。大多数mRNA疫苗旨在产生中和IgG抗体，而中和IgG抗体只能通过肌肉免疫有效保护下呼吸道。然而，主要负责保护上呼吸道的IgA抗体可能是消毒免疫所必需的，并且mRNA疫苗诱导的IgA抗体水平在目前的临床试验中尚未确定。此外，尽管mRNA-1273的研究结果表明，在人类初次接种疫苗后，高中和抗体滴度至少持续4个月，但这些mRNA疫苗能够保护人类抵抗COVID-19的时间还有待进一步阐明。

另一方面，仍然需要生成数据来评估mRNA疫苗是否适合所有人，包括儿童、老年人、免疫抑制个体以及自身免疫疾病等慢性病患者。与不同药物的相容性也需要评估。mRNA疫苗诱导的I型IFN应答是否会成为各种潜在疾病患者或I型IFN治疗患者的问题？其中一些类型的调查已经开始或计划进行。在经批准的SARS-CoV-2 mRNA疫苗分销过程中，mRNA疫苗的其他问题引起了卫生保健系统的极大关注，包括冷链和储存限制。即使在高收入国家，许多门诊和疫苗接种点也无法使用低温冰箱，以满足某些mRNA疫苗的需求，这一挑战在低收入国家将更加突出。因此，迫切需要对这些问题进行改进和验证。

mRNA疫苗的其它临床应用

自从Wolf等人证明可以从活组织中的体外转录mRNA产生蛋白质以来，mRNA疫苗已经在许多应用中证明了其有效性。首次使用基于RNA脉冲DC癌症疫苗的mRNA技术进行临床试验的记录可以追溯到2003年。今天，可以发现超过140项临床试验使用mRNA来解决癌症或传染病等不同情况（图4）。

图4 每年根据疾病类型（左）和递送系统（右）提交的 mRNA 疫苗临床试验的细分

癌症是目前mRNA技术的首选目标，超过50%的临床试验集中于黑色素瘤、前列腺癌和脑癌的治疗（图5），大多数试验仍处于早期阶段（I和II）。除了安全性和免疫反应外，缺乏癌症治疗的基准阻碍了对疫苗有效性的评估。然而，传染病的情况并非如此，因为许多传统疫苗可用作验证新mRNA疫苗的基准。mRNA还显示出其它潜力，不仅可用于治疗癌症，也可在许多其他疾病（如心血管疾病和II型糖尿病）中作为蛋白质表达的治疗剂。

图5 mRNA疫苗的应用

表2和表3梳理了针对癌症与传染性疾病的mRNA疫苗的临床应用情况。

表2 针对癌症的mRNA疫苗的临床试验

表3 针对病毒性疾病的mRNA 疫苗的临床试验

有效性

mRNA疫苗通过几种可能的途径导致适应性免疫：（1）转染体细胞，如肌肉细胞和表皮细胞，（2）在注射部位转染组织驻留的免疫细胞，（3）在次级淋巴组织（包括淋巴结（LN）和脾脏）中转染免疫细胞（图1）。

图1 肌肉注射mRNA疫苗的作用方式

对于注射的mRNA疫苗，有效性的主要考虑因素包括：专业抗原呈递细胞（APC）中的抗原表达水平，其受载体效率、双链RNA（dsRNA）或未修饰核苷形式的病原体相关分子模式（PAMP）和RNA序列的优化水平（密码子使用、G:C含量、5′和3′非翻译区（UTR）等）的影响；树突状细胞（DC）成熟并向次级淋巴组织迁移，PAMPs增强了这一过程；疫苗激活强大的T滤泡辅助细胞（TFH）和生发中心（GC）B细胞反应的能力——这一领域仍知之甚少。图2以皮内注射为例，分析了影响注射mRNA疫苗有效性的因素。

图2 对直接注射mRNA疫苗有效性的考虑

安全性

与目前的许多疫苗接种策略（如DNA疫苗）相比，mRNA的生产速度更快、更灵活、成本更低，可用于精准和个体化的治疗，同时mRNA不会整合到宿主基因组中，保证了基本的安全性。与大多数生物制品的生产相比，mRNA制造是有优势的，它不需要使用细胞培养；反应时间快，污染风险低于其他复杂疫苗生产。此外，细胞内的非整合性质和瞬时表达有利于mRNA的安全性。

现代预防性疫苗的安全性要求非常严格，因为疫苗是给健康人接种的。由于mRNA的制造过程不需要可能被外来病毒污染的有毒化学品或细胞培养物，因此mRNA的生产避免了与其他疫苗平台（包括活病毒、病毒载体、灭活病毒和亚单位蛋白疫苗）相关的常见风险。

已经对几种不同的mRNA疫苗进行了从I期到IIb期临床研究测试，结果表明它们是安全的，并且耐受性良好。然而，最近的人体试验表明，不同mRNA平台的注射部位或全身存在中等程度的反应，罕见情况下可出现严重反应。在未来临床前和临床研究中可能评估的潜在安全问题包括局部和全身炎症、表达免疫原的生物分布和持久性、自身反应性抗体的刺激以及任何非天然核苷酸和传递系统成分的潜在毒性作用。一个可能引起人们担忧的是，一些基于mRNA的疫苗平台会诱导有效的I型干扰素反应，这种反应不仅与炎症有关，还可能与自身免疫有关。因此，在mRNA疫苗接种前识别自身免疫反应风险增加的个体，可以采取合理的预防措施。

另一个潜在的安全问题可能源于mRNA疫苗接种期间细胞外RNA的存在。细胞外裸RNA已被证明可增加紧密堆积的内皮细胞的通透性，因此可能导致水肿。另一项研究表明，细胞外RNA可促进血液凝固和病理性血栓形成。因为不同的mRNA模式和传递系统首次在人类中使用，并在更大的患者群体中进行测试，所以需要继续评估其安全性。在系统性红斑狼疮和其他自身免疫性疾病患者中，有人提出抗自身RNA抗体的产生可能触发和发展自身免疫。除此之外，与递送化合物、络合剂以及潜在插入核苷酸相关的毒性副作用的残余风险仍然存在。

目前正在考虑关于评估基于RNA的感染性疾病预防疫苗的质量、安全性和有效性的法规指南。现在的重点是建立能够提供高质量和一致性产品的制造流程。因此，必须定义一些关键工艺步骤和验收标准、中间体、原料药（DS）和药品（DP）的规范，例如，根据产品产量和允许严格产品量化和表征（产品标识、纯度和质量）的分析技术。mRNA质量可以使用多种分析技术进行评估，如凝胶电泳和高效液相色谱（HPLC），可以使用测序技术确定其身份，如逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）或下一代测序。必须确定是否存在残留的DNA、酶和溶剂，以及dsRNA和截断的RNA片段。此外，作为一般质量控制，还必须评估内毒素的存在、总体无菌性和mRNA稳定性等方面。

展望

基于mRNA的疫苗是一种很有前途的新型平台，具有高度通用性、有效性、精简性、可扩展性、廉价和无冷链的潜力。重要的是，基于mRNA的疫苗可能填补新兴大流行性传染病与快速、充足的有效疫苗供应之间的空白。与传统疫苗相比，mRNA疫苗技术具有巨大的潜力。这种多功能RNA疫苗平台在发现和开发的速度和成本、许多目标的成功概率以及针对新威胁的有效疫苗的快速生产方面提供了优势。然而，要完全了解其在人体内的安全性和有效性还为时过早。最近公布的两项针对传染病的常规mRNA疫苗临床试验结果显示，总体上耐受性良好、免疫原性良好，但根据动物试验结果，反应比预期更温和。需要进一步深入了解作用机制，以了解由mRNA和传递系统产生的先天免疫反应的影响，并确定从动物物种学习如何转化到人类。

未来5年将对mRNA疫苗领域非常重要，人体临床试验的结果将使人们更清楚地了解该技术的真正前景，并深入了解正在开发的各种mRNA技术和传递系统的优缺点。